Mechanizmy działania nebivololu na komórki mięśni gładkich naczyń

Jak nebivolol wpływa na komórki mięśni gładkich?

Nebivolol wykazuje dwufazowy wpływ na komórki mięśni gładkich naczyń stymulowane bFGF – odkryto różnice mechanistyczne w porównaniu z selektywnym agonistą receptorów β₃-adrenergicznych. Badania nad mechanizmami przeciwdziałania restenozie naczyniowej po angioplastyce wieńcowej stanowią kluczowy element poprawy wyników długoterminowych zabiegów interwencyjnych. Jednym z głównych czynników ryzyka restenozy jest nasilona proliferacja i migracja komórek mięśni gładkich naczyń (VSMC) wywołana odpowiedzią zapalną i zwiększoną ekspresją czynników wzrostu po urazie naczynia.

Angioplastyka wieńcowa jest małoinwazyjną procedurą stosowaną do udrożnienia zablokowanych tętnic wieńcowych spowodowanych przez miażdżycę. Główną wadą tego zabiegu jest rozwój restenozy, która wynika głównie z nadmiernej regulacji czynników wzrostu i mediatorów zapalnych, prowadzących do migracji i proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń (VSMC) oraz następczego pogrubienia neointimy. Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) jest jednym z głównych czynników wzrostu zaangażowanych w ten proces, stymulując szlaki kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAP) oraz kinazy białkowej B (AKT).

bFGF wywołuje swoje efekty poprzez wiązanie się ze swoimi specyficznymi receptorami (receptory FGF), co powoduje fosforylację receptora i dalsze wiązanie z białkami adaptatorowymi. Ta interakcja aktywuje szlaki MAPK i AKT. Aktywowane MAPK i/lub AKT przemieszczają się do jądra komórkowego, stymulując ekspresję genów związanych z proliferacją i migracją komórek. Proces ten indukuje zmianę fenotypu komórek mięśni gładkich z kurczliwego na proliferacyjny oraz zmiany polarności komórek, prowadząc do proliferacji i migracji komórek. Wcześniejsze badania wykazały, że blokada szlaków MAPK i AKT hamuje indukowaną przez bFGF proliferację i migrację komórek mięśni gładkich naczyń, a także hiperplazję intimy wywołaną urazem naczyniowym, co sugeruje, że indukowana przez bFGF aktywacja szlaku MAPK i AKT jest zaangażowana w restenozę naczyniową wywołaną urazem naczyniowym.

Receptory β₃-adrenergiczne (β₃-AR) należą do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), które występują w wielu układach i tkankach, takich jak tkanka tłuszczowa i mięśnie gładkie mięśnia wypieracza. W układzie sercowo-naczyniowym receptory β₃-AR odgrywają znaczącą rolę w funkcji serca, napięciu naczyniowym i funkcji śródbłonka – szczególnie w przypadkach niewydolności serca. Receptory β₃-AR są słabo wyrażone w zdrowej tkance mięśnia sercowego, ale ulegają nadekspresji w niewydolności serca. Aktywacja receptorów β₃-AR w tkankach mięśnia sercowego w niewydolności serca ma negatywny efekt inotropowy, który obejmuje szlak zależny od tlenku azotu. Ta zwiększona aktywność receptorów β₃-AR służy jako mechanizm ochronny w przypadku niewydolności serca, gdzie aktywność współczulna jest wysoka. Co istotne, receptory β₃-AR mogą również zmniejszać napięcie mięśni gładkich naczyń i indukować rozszerzenie naczyń poprzez sygnalizację eNOS/GMP.

Czy badania laboratoryjne odsłaniają mechanizmy nebivololu?

W przeprowadzonym badaniu analizowano działanie nebivololu – selektywnego antagonisty receptorów β₁-adrenergicznych z właściwościami agonistycznymi wobec receptorów β₃-adrenergicznych – porównując jego wpływ z działaniem CL316,243 (selektywnego agonisty receptorów β₃-AR) na proliferację i migrację VSMC stymulowanych zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). Wcześniejsze badania sugerowały hamujący wpływ nebivololu na proliferację VSMC poprzez agonizm receptorów β₃-AR, jednak opublikowane dane wskazywały, że uraz naczyniowy zwiększa ekspresję receptorów β₃-AR w neointimie, a leczenie VSMC za pomocą CL316,243 nasilało indukowaną przez bFGF proliferację i migrację.

Główne odkrycia obecnego badania obejmują: 1) dwufazowy, zależny od dawki wpływ nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację komórek – nasilenie przy niskich stężeniach i hamowanie przy wysokich stężeniach, 2) hamowanie przez nebivolol we wszystkich badanych stężeniach migracji komórek indukowanej przez bFGF, 3) hamowanie przez wyższe stężenia nebivololu fosforylacji AKT indukowanej przez bFGF, bez wpływu na fosforylację ERK.

W badaniu wykorzystano komórki VSMC izolowane z aorty piersiowej samców szczurów Sprague-Dawley poprzez enzymatyczne rozdzielenie. Uzasadnienie użycia VSMC izolowanych od samców szczurów Sprague-Dawley opierało się na następujących odkryciach: 1) częstość występowania miażdżycy tętnic wieńcowych jest wyższa u mężczyzn niż u kobiet, 2) receptory β₃-AR ulegają nadekspresji w modelu urazu tętnicy szyjnej u samców, a aktywacja receptorów β₃-AR potęguje indukowaną przez bFGF proliferację i migrację VSMC. Eksperymenty przeprowadzono na komórkach z pasaży 10-15, aby naśladować fenotyp morfologiczny i funkcjonalny występujący w neointimie po urazie naczyniowym.

Migrację komórek mierzono za pomocą testu gojenia ran, a proliferację komórek mierzono przy użyciu resazuryny – pośredniej metody pomiaru proliferacji komórek poprzez monitorowanie liczby żywych komórek. Fosforylację ERK i AKT mierzono za pomocą analizy Western blot.

Badania wykazały, że działanie nebivololu na proliferację VSMC zależy od stężenia. Pięć stężeń (0,1, 0,3, 1, 3 i 10 μM) nebivololu wykorzystano do przetestowania efektów zależnych od dawki na indukowaną przez bFGF proliferację komórek mięśni gładkich. Leczenie samym nebivololem w niskich stężeniach (0,1 μM i 0,3 μM) przez 24 godziny znacząco zwiększyło proliferację komórek w porównaniu z kontrolą (25%). Wstępne traktowanie niskimi stężeniami nebivololu zwiększyło indukowaną przez bFGF proliferację komórek w sposób addytywny, podczas gdy wyższe stężenia nebivololu, zwłaszcza 3 i 10 μM, zmniejszyły indukowaną przez bFGF proliferację komórek (manifestującą się jako 17% spadek dla 3 μM i 33% spadek dla 10 μM w porównaniu z samym bFGF).

W przeciwieństwie do nebivololu, CL316,243 przy wszystkich badanych stężeniach (0,1, 0,3, 1, 3 i 10 μM) potęgował proliferację komórek indukowaną przez bFGF. Samo leczenie CL316,243 nieznacznie, ale nieistotnie zwiększyło proliferację komórek w porównaniu z kontrolą. Gdy komórki były wstępnie traktowane CL316,243 we wszystkich badanych stężeniach, proliferacja była znacząco potęgowana w porównaniu z samym bFGF. Nie zaobserwowano hamowania proliferacji komórek, nawet przy najwyższym badanym stężeniu CL316,243. Dwufazowe wyniki obserwowane przy nebivololie nie były obserwowane przy CL316,243, co sugeruje, że nebivolol może działać poprzez inne mechanizmy niż CL316,243 wpływając na indukowaną przez bFGF proliferację komórek, przynajmniej częściowo przy wyższych stężeniach.

Stężenie 0,3 μM zastosowano zarówno dla nebivololu, jak i CL316,243 w eksperymentach migracji komórek. Jak pokazano, sam bFGF w stężeniu 5 ng/ml znacząco zwiększał migrację komórek. Zarówno nebivolol, jak i CL316,243 same w stężeniu 0,3 μM nie wykazywały istotnego wpływu na migrację komórek. Wstępne traktowanie VSMC 0,3 μM nebivololu znacząco hamowało indukowaną przez bFGF migrację komórek, manifestującą się jako 38% redukcja w porównaniu z samym leczeniem bFGF. W przeciwieństwie do wyników obserwowanych przy nebivololie, wstępne traktowanie VSMC 0,3 μM CL316,243 potęgowało indukowaną przez bFGF migrację komórek, manifestującą się jako 13% wzrost w porównaniu z samym leczeniem bFGF.

Wcześniejsze badania wykazały, że efekty bFGF są mediowane przez aktywację efektorów downstream, w tym kaskad ERK/MAPK i PI3K/AKT. Opublikowane dane sugerują, że aktywacja szlaków sygnałowych ERK i AKT jest zaangażowana w mediowane przez wysokie stężenia (2 i 5 μM) CL316,243 efekty na indukowaną przez bFGF proliferację i migrację VSMC. Aby zrozumieć, czy niskie stężenia nebivololu i CL316,243 aktywują te same szlaki w zwiększaniu indukowanej przez bFGF proliferacji komórek, przetestowano wpływ niskich stężeń nebivololu i CL316,243 na indukowaną przez bFGF fosforylację ERK i AKT. Komórki były wstępnie traktowane 0,3 μM nebivololu lub CL316,243 przez 24 godziny, a następnie stymulowane 5 ng/ml bFGF przez 10 minut. Ani nebivolol, ani CL316,243 w badanym stężeniu nie wykazywały żadnego wpływu na indukowaną przez bFGF fosforylację ERK lub AKT, co sugeruje, że oba szlaki sygnałowe mogą nie być zaangażowane w zmiany funkcjonalne komórek spowodowane niskimi stężeniami nebivololu i CL316,243, chociaż zarówno nebivolol, jak i CL316,243 w badanym stężeniu wykazywały wzrost indukowanej przez bFGF proliferacji komórek.

Ponieważ niskie stężenia nebivololu wywoływały podobne efekty na indukowaną przez bFGF proliferację komórek jak CL316,243, kolejny eksperyment miał na celu sprawdzenie, czy wyniki obserwowane przy niskich stężeniach nebivololu zachodzą poprzez aktywację receptorów β₃-AR. VSMC wstępnie traktowano różnymi stężeniami selektywnego antagonisty receptorów β₃-AR, SR59230A, w obecności lub braku nebivololu, a następnie stymulowano bFGF, aby sprawdzić, czy SR59230A blokuje wpływ niskiego stężenia nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację komórek. Sam SR59230A nie miał istotnego wpływu na proliferację komórek, ale blokował wpływ nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację komórek w stężeniach 1 i 3 μM, co sugeruje, że aktywacja receptorów β₃-AR jest zaangażowana w wpływ niskich stężeń nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację komórek.

Ponieważ niższe stężenia nebivololu wywoływały przeciwne efekty na indukowaną przez bFGF migrację komórek w porównaniu z CL316,243, kolejne eksperymenty miały na celu sprawdzenie, czy ta sama tendencja występuje przy wyższych stężeniach obu środków. Nebivolol w stężeniu 3 μM sam nie wpływał na migrację VSMC, podczas gdy 10 μM nebivololu hamowało migrację VSMC. Nebivolol w obu stężeniach hamował indukowaną przez bFGF migrację VSMC, co jest podobne do wyników obserwowanych przy niższym stężeniu (0,3 μM). W przeciwieństwie do danych uzyskanych z nebivololu, wysokie stężenia CL316,243 wywoływały przeciwny efekt na indukowaną przez bFGF migrację komórek, manifestującą się jako potęgowanie indukowanej przez bFGF migracji komórek, co jest zgodne z wynikami obserwowanymi przy niskim stężeniu CL316,243 (0,3 μM).

Aby zrozumieć mechanizmy wpływu wyższych stężeń nebivololu na indukowane przez bFGF zmiany funkcjonalne komórek, przetestowano, czy zaangażowane są szlaki sygnałowe ERK i AKT. Wysokie stężenia nebivololu (3 i 10 μM) hamowały indukowaną przez bFGF fosforylację AKT, ale nie fosforylację ERK, co sugeruje, że tylko szlak AKT może być zaangażowany. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami, wyższe stężenia CL316,243 nasilały indukowaną przez bFGF fosforylację zarówno ERK, jak i AKT.

Jakie mechanizmy leżą u podstaw efektów klinicznych nebivololu?

Wyniki wskazują, że mechanizmy wpływu nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację i migrację VSMC mogą obejmować różne szlaki. Odpowiedzi zależne od dawki i funkcji odzwierciedlają zaangażowanie więcej niż jednego mechanizmu. Jednym z głównych mechanizmów zaangażowanych w efekty mediowane przez nebivolol mogą być jego właściwości antyoksydacyjne. Doniesiono, że restenoza indukowana urazem naczyniowym wiąże się z produkcją reaktywnych form tlenu (ROS) i zmniejszeniem ekspresji i aktywności enzymów zaangażowanych w produkcję i degradację tlenku azotu (NO), co może zmniejszyć poziom NO. Liczne badania wskazują, że nebivolol posiada właściwości antyoksydacyjne. Nebivolol zmniejsza wewnątrzkomórkowe tworzenie ROS i zapobiega wyczerpaniu wewnątrzkomórkowego NO, co przypisuje się jego właściwościom wymiatania wolnych rodników, których nie obserwuje się w przypadku propranololu (nieselektywnego antagonisty receptorów β) ani metoprololu (selektywnego antagonisty receptorów β₁).

Dodatkowo wykazano, że nebivolol ma właściwości przeciwzapalne. Wolf i wsp. ujawnili, że leczenie ludzkich komórek mięśni gładkich tętnic wieńcowych nebivololem zmniejsza ekspresję genów zaangażowanych w stan zapalny, w tym interleukiny-1α (IL-1α), czynnika martwicy nowotworów (TNF)-α oraz genów związanych z onkogenami 2 i 3; oraz zwiększa ekspresję genów zaangażowanych w ochronę przed stresem oksydacyjnym, w tym seladyny-1 i receptora 1 naczyniowo-aktywnego peptydu jelitowego (VIPR1). Efektów tych nie obserwowano w przypadku metoprololu w tym samym stężeniu. Powszechnie wiadomo, że odpowiedź zapalna jest początkowym etapem restenozy indukowanej urazem naczyniowym. Po urazie naczyniowym stwierdzono zwiększoną ekspresję i odpowiedź cząsteczek zapalnych. Właściwości przeciwzapalne nebivololu mogą przyczyniać się do działania anty-mitogennego i anty-motogennego w VSMC, a także do jego zdolności do zmniejszania tworzenia neointimy indukowanej urazem naczyniowym.

Brehm i wsp. wykazali również, że nebivolol blokuje wejście w fazę cyklu komórkowego G2 (szybki wzrost komórek i synteza białek przygotowująca do mitozy) i w sposób zależny od dawki indukuje apoptozę VSMC, co sugeruje, że może to być jeden z czynników zaangażowanych w mediowane przez nebivolol efekty na proliferację VSMC.

Na podstawie uzyskanych danych, szlaki transdukcji sygnału zaangażowane w efekty mediowane przez wysokie stężenia nebivololu wydają się być przynajmniej częściowo związane z hamowaniem fosforylacji AKT, ale nie fosforylacji ERK, co jest przeciwne do wyników obserwowanych w przypadku agonisty receptorów β₃-AR, CL316,243. Potwierdza to hipotezę, że hamujący wpływ nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację i migrację VSMC może nie zachodzić poprzez agonizm receptorów β₃-AR, ale raczej poprzez działanie antyoksydacyjne, przeciwzapalne i/lub zapobieganie wejściu komórek w fazę G2. Mechanizm różnicowego wpływu nebivololu na szlaki sygnałowe AKT i ERK przy wysokich stężeniach nie jest jasny. Chociaż zarówno szlaki AKT, jak i MAPK są zaangażowane w proliferację i migrację VSMC, dokładna różnica między ich celami downstream nie jest w pełni zrozumiała. Zhang i wsp. odkryli, że przełączanie fenotypu VSMC jest regulowane przez równowagę między sygnalizacją AKT i MAPK podczas starzenia się i nadciśnienia, charakteryzującą się zmniejszoną sygnalizacją AKT, ale zwiększoną sygnalizacją MAPK, co sugeruje, że szlaki AKT i MAPK mogą różnie reagować na różne bodźce w określonych warunkach.

Wyniki sugerują, że nebivolol prawdopodobnie działa przynajmniej częściowo/przy niższych stężeniach poprzez agonizm receptorów β₃-AR w kontekście zwiększania indukowanej przez bFGF proliferacji VSMC. Inne mechanizmy, takie jak właściwości antyoksydacyjne i/lub przeciwzapalne, mogą być zaangażowane w mediowane przez nebivolol efekty na indukowaną przez bFGF migrację VSMC, a także w efekty mediowane przez wysokie stężenia nebivololu na indukowaną przez bFGF proliferację VSMC. Przyszłe badania będą potrzebne, aby zgłębić potencjalny mechanizm działania nebivololu.

Obecne badanie poszerzyło nasze zrozumienie złożonych mechanizmów leżących u podstaw wpływu nebivololu na proliferację i migrację VSMC. Wyniki mogą przyczynić się do opracowania potencjalnego podejścia terapeutycznego wykorzystującego wyższe stężenia nebivololu po angioplastyce w celu zmniejszenia ryzyka restenozy naczyniowej związanej z procedurą.

Podsumowanie

Badania wykazały, że nebivolol wywiera dwufazowy wpływ na komórki mięśni gładkich naczyń (VSMC) stymulowane zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). W niskich stężeniach (0,1-0,3 μM) zwiększa proliferację komórek poprzez aktywację receptorów β3-adrenergicznych, podczas gdy w wysokich stężeniach (3-10 μM) hamuje zarówno proliferację, jak i migrację komórek. Mechanizm działania wysokich stężeń nebivololu obejmuje hamowanie fosforylacji AKT, bez wpływu na fosforylację ERK. W przeciwieństwie do selektywnego agonisty receptorów β3-AR (CL316,243), nebivolol wykazuje dodatkowe właściwości antyoksydacyjne i przeciwzapalne. Działanie to może być szczególnie istotne w kontekście zapobiegania restenozie po zabiegach angioplastyki wieńcowej, gdzie nadmierna proliferacja i migracja komórek mięśni gładkich prowadzi do zwężenia naczyń. Wyniki badań sugerują potencjalne zastosowanie wyższych stężeń nebivololu jako strategii terapeutycznej w zapobieganiu restenozie pozabiegowej.

Bibliografia

Seemann Elaina, Beeler Trevor, Alfarra Mohammed, Cosio Mark, Chan Charles, Grant Peyton and Chang Yingzi. Mechanisms of nebivolol-mediated effects on bFGF-induced vascular smooth muscle cell proliferation and migration. Current Research in Pharmacology and Drug Discovery 2025, 8(3), 235-253. DOI: https://doi.org/10.1016/j.crphar.2025.100214.